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近期，約翰霍普金斯大學醫(yī)學院的研究人員在Science期刊發(fā)表研究成果^[1]。他們發(fā)現(xiàn)了靶向TP53突變的新抗原，篩選出一種抗體片段（H2-scFv）特異性識別滅活的腫瘤抑制基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，通過實時監(jiān)測T細胞殺傷效應，證實了該抗體片段的有效性，開創(chuàng)了靶向療法的新領(lǐng)域。此研究中，Incucyte®被選擇并應用于免疫細胞腫瘤殺傷活性的實時動態(tài)分析。

Incucyte® 實時活細胞分析系統(tǒng)

Incucyte®有什么優(yōu)勢呢？

免疫細胞腫瘤殺傷活性的體外評價過程涉及到免疫細胞和腫瘤細胞兩種細胞存在，因此不能采用傳統(tǒng)的細胞增殖活性檢測手段（如MTT、ATP等方法）直接進行檢測。目前常用的免疫細胞殺傷研究方法包括 51鉻釋放試驗、流式細胞術(shù)、 ELISpot、3H 胸腺嘧啶和 ATP 檢測。這些方法步驟繁瑣，耗費時間和人力，很難實現(xiàn)對效應細胞和靶細胞之間相互作用的研究。Incucyte® 位于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，可以長時程自動采集相差和熒光圖片，實時觀察并全自動分析腫瘤細胞殺傷和免疫細胞與腫瘤細胞之間的相互作用，配合Cell-By-Cell軟件模塊可以自動地完成圖片的定量分析，直接測定腫瘤細胞的死亡及活力。

H2-scDb 特異性識別表達 p53R175H 新抗原的癌細胞

H2-scDb 識別表達不同量 HLA-A*02:01 并具有不同 p53 突變狀態(tài)的癌細胞系的能力，即使H2-scDb的濃度非常低，對T細胞的激活功能也是非常明顯的，T 細胞反應導致靶細胞的有效殺傷，并且是多功能的，如細胞毒性顆粒蛋白顆粒酶 B 和穿孔素的釋放以及細胞因子 IFN-γ、腫瘤壞死因子 α (TNF-α)、白細胞介素2 (IL-2) 等（圖 2A）。腫瘤細胞周圍的 T 細胞聚集，導致它們在 H2-scDb 存在下裂解，也通過Incucyte® 實時活細胞成像進行可視化(圖 2B)。

圖 2.（A）細胞毒性顆粒蛋白顆粒酶B和穿孔素的釋放以及細胞因子IFN-γ、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2）等曲線；（B）綠色熒光蛋白（GFP）標記的TYK-nu與T細胞共培養(yǎng)，E:T比為5:1，有或沒有H2-scDb在Incucyte®系統(tǒng)中連續(xù)監(jiān)測，顯示24小時和96小時拍攝的相位和綠色熒光圖像。

研究人員基于 CRISPR 的技術(shù)對攜帶內(nèi)源性 HLA-A*02:01 和 p53R175H 的 KMS26、KLE 和 TYK-nu 癌細胞系中的 TP53 進行了基因破壞。H2-scDb 介導的細胞毒性通過破壞這些細胞中的 TP53 類似地減輕，通過Incucyte® 連續(xù)檢測超過120h，呈現(xiàn)動態(tài)的定量化殺傷效果(圖3)。

圖 3. TP53野生型（左）或突變型（右）的綠色熒光蛋白（GFP）標記的TYK-nu細胞中加入不同濃度的H2-scDb和T細胞以E:T為2:1的比例進行共培養(yǎng)。實時活細胞成像檢測TYK-nu細胞的生長。

文章討論了該抗體片段（H2-scFv），可以特異性識別滅活的腫瘤抑制基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而不識別完整細胞中的 WT 形式，且對蛋白質(zhì)的突變形式具有特異性。H2 (H2-scDb) 構(gòu)建的雙特異性抗體可以激活 T 細胞，誘導多功能 T 細胞效應反應，包括細胞毒活性和多種細胞因子的產(chǎn)生，更好的詮釋了T細胞對腫瘤殺傷的效果。因此，可以將該雙特異性抗體作為新型抗體療法的突破口。

總結(jié)

在觀察免疫殺傷時，往往需要通過長時間的藥物處理，比如ADCC和ADCP效應，細胞因子釋放，逐漸達到治療效果。不僅需要觀察細胞形態(tài)，同時需要監(jiān)測細胞因子的產(chǎn)生速率以及殺傷效率，傳統(tǒng)的檢測手段很容易錯失最佳檢測時機。

Incucyte®可直接安裝在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，對細胞自動連續(xù)（數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月）拍照獲取活細胞的明場和熒光圖像，實時觀察并全自動分析腫瘤細胞殺傷和免疫細胞與腫瘤細胞之間的相互作用，即混即讀的 96/384 孔檢測非常適用于篩選試驗，為加速臨床前的藥物篩選和開發(fā)提供了令人興奮的機會。