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腫瘤藥物和腫瘤耐藥性一直存在 “矛”和“盾”的關(guān)系。2022年9月，圣裘德兒童研究醫(yī)院DR. Green研究團隊在國際最權(quán)威的學術(shù)期刊之一Cell上發(fā)表了《Sublethal cytochrome c release generates drug-tolerant persister cells》一文，揭示了亞致死性細胞色素c釋放產(chǎn)生藥物耐受持久性細胞的機制。藥物耐受持久性細胞會在腫瘤常規(guī)治療以及靶向治療中逃避細胞凋亡，是有效癌癥治療的主要非遺傳障礙。

示意圖：細胞色素c誘導血紅素調(diào)節(jié)抑制劑（HRI）激酶的激活以及整合應(yīng)激反應(yīng)（ISR）的參與，促進ATF4的合成，使腫瘤細胞“逃出生天”，引發(fā)后續(xù)的不良預(yù)后。

持久性細胞系的制備

持久性細胞在功能上定義為細胞死亡誘導處理后仍然存活的細胞。研究人員發(fā)現(xiàn)使用針對bcl-2、bcl-xl、bcl-w的抑制劑處理后存活下來的細胞會表現(xiàn)出持久性表型，包括體內(nèi)定植、轉(zhuǎn)移以及對GPX4抑制鐵死亡的敏感性增加。

首先，研究人員通過Incucyte® 實時活細胞分析系統(tǒng)確認了細胞給藥的最大靶向劑量，然后構(gòu)建了持久性細胞模型，發(fā)現(xiàn)持久性細胞可以使小鼠具有更高的腫瘤負荷，轉(zhuǎn)移率檢測發(fā)現(xiàn)持久性細胞具有更高的轉(zhuǎn)移能力。

Incucyte® 定量分析加入1.5 mM ABT737和3 mM S63845 (S6) 抑制劑處理后，PC9 WT(野生型)細胞 、PC9 DKO (BAX和BAK雙敲除)細胞、PC9 TKO(BAX、BAK和BOK三重敲除)細胞、40 mM Q-VD-OPh+ PC9 WT細胞（加入抗凋亡藥物對照組）的死亡情況確認細胞給藥的最大靶向劑量，400 ng/mL PI作為死細胞染料；尾靜脈注射熒光素酶標記細胞的活體評估表明，注射持久性細胞的小鼠具有更高的腫瘤負荷。

接下來，研究人員發(fā)現(xiàn)持久性表型在很大程度上取決于Bcl-2家族效應(yīng)蛋白，使用bcl-2、bcl-xl、bcl-w的抑制劑處理BAX、BAK和BOK（TKO）缺陷的PC9（PS）細胞，并將其與野生型PT細胞進行比較，TKO PS的肺定殖能力及轉(zhuǎn)移潛力與PT細胞無顯著性差異。

熒光素酶或CTV 、CFSE標記細胞分析表明持久性細胞表型依賴于Bcl-2。

細胞色素c-HRI-AT4通路驅(qū)動藥物耐受持久性表型的產(chǎn)生

為了進一步了解持久性表型產(chǎn)生的機制，研究人員對抑制劑處理后不同時間點的PC9 PT和相應(yīng)的PS進行了單細胞RNA測序。轉(zhuǎn)錄組學軌跡分析揭示了持久性細胞中短暫的ISR（綜合應(yīng)激反應(yīng)）表達譜，并且確定了抑制劑誘導的ISR，依賴于Bcl-2效應(yīng)蛋白，但不依賴于胱天蛋白酶激活。而且亞致死MOMP（線粒體外膜透化）的參與對ISR激活至關(guān)重要，細胞色素c激活血紅素調(diào)節(jié)抑制劑 (HRI)并參與持久性表型。最終研究結(jié)果表明，細胞色素c-HRI-AT4通路驅(qū)動藥物耐受持久性表型的產(chǎn)生。

Incucyte® 分析加入1.5 mM ABT737和3 mM S6 處理細胞色素酶敲除后重新表達pCYCS WT（細胞色素酶野生型） 或者pCYCS K72R（細胞色素酶突變型）的細胞死亡情況，表明細胞色素c參與持久性表型，400 ng/mL PI作為死細胞染料。

Incucyte® 定量分析1.5 mM ABT737和3 mM S6處理的單獨轉(zhuǎn)染或組合轉(zhuǎn)染siNT、siBAX、siBAK、siBOK的 PC9細胞死亡情況，表明單獨BAX的缺失幾乎完全消除了對藥物的敏感性，BAX為效應(yīng)蛋白，400 ng/mL PI作為死細胞染料。

這一新發(fā)現(xiàn)解釋了為什么腫瘤細胞容易對治療藥物產(chǎn)生耐藥性，雖然不同的治療藥物作用機制可能不同，但大多數(shù)藥物最終都會誘導細胞死亡，當細胞死亡被抑制，這些持久性細胞會對癌癥治療產(chǎn)生耐藥性，本研究結(jié)果為開發(fā)通過抑制癌細胞獲得持久性特征來阻止復發(fā)的藥物奠定了基礎(chǔ)。

在本研究中，研究人員多次通過Incucyte® S3實時活細胞分析系統(tǒng)監(jiān)測與分析細胞死亡，用于確認細胞給藥的最大靶向劑量、關(guān)鍵蛋白是否參與持久性表型等。

為什么要用Incucyte® 實時活細胞分析系統(tǒng)？

培養(yǎng)箱內(nèi)可長達數(shù)周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過多操作對細胞的傷害；這篇文章部分實驗細胞在處理8小時后就會出現(xiàn)明顯的死亡,每30min自動對細胞進行檢測，實時記錄并定量分析細胞死亡情況，可以不錯過實驗的關(guān)鍵信息，并保證細胞處在穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境中；

6個板位，分別獨立設(shè)置檢測程序，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿，通量高；

高效簡便的模塊化軟件設(shè)置和數(shù)據(jù)分析，輸出圖片、視頻、生長曲線等多指標多參數(shù)；

大于100種優(yōu)化過的活細胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol。文章數(shù)大于12000篇，是長時間活細胞成像產(chǎn)品中最多。